همسانه سازی ژن اینترفرون گامای انسانی و بررسی امکان انتقال به سیستم بیانی گیاه

امروزه تقاضای زیادی برای تولید پروتئین های نوترکیب انسانی جهت درمان و تشخیص وجود دارد. اینترفرون گاما نیز به عنوان یکی از این پروتئین های ارزشمند، وسیله دفاعی بدن در مقابل ویروس ها می باشد و ارزش درمانی بالایی دارد، از این رو به عنوان دارو برای آلودگی های ویروسی، سرطان ها و بیماری های خودایمن مورد استفاده قرار می گیرد. در این پژوهش آغازگرهای مناسب با توجه به توالی های افزایش دهنده بیان گیاهی، توالی های دو طرف ژن اینترفرون گاما، محل های برش مناسب، توالی his tag جهت شناسایی و تخلیص پروتئین و فاکتور هگزا جهت حذف his tag طراحی و برای تکثیر ژن استفاده شد. ژن مورد نظر در ناقل بیانی گیاهی pcambia1304 تحت کنترل پیشبرنده camv35s و خاتمه دهنده nos همسانه سازی شد. سازه بدست آمده (pcamifn-?) با روش شوک حرارتی به باکتری اشریشیاکلی سویه dh5? منتقل شده و باکتری های تراریخته بر روی محیط حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین 50 میلی گرم در لیتر انتخاب شدند. با استفاده از تکنیک های مختلف colony pcr، هضم آنزیمی، توالی یابی و هم ردیف سازی آن در بانک اطلاعاتی حضور ژن اینترفرون گاما در ناقل بیانی تایید شد. سپس سازه مورد نظر با روش استاندارد انجماد و ذوب به باکتری اگروباکتریوم سویه lba4404 منتقل شده و برای تراریختی گیاه گوجه فرنگی(رقم cal j) از طریق ریزنمونه های کوتیلدونی و به روش دیسک برگی مورد استفاده قرار گرفت. به منظور تلقیح در ابتدا ریزنمونه ها به مدت 48 ساعت بر روی محیط پیش-کشت قرار گرفته، سپس مایه زنی با اگروباکتریوم انجام شده و ریزنمونه ها به مدت 48 ساعت در تاریکی و دمای 28 درجه بر روی محیط هم-کشت قرار گرفتند. در نهایت ریزنمونه های تلقیح شده به محیط کشت انتخابی که شامل محیط هم-کشت به همراه آنتی بیوتیک های سفوتاکسیم 250 میلی گرم در لیتر و هیگرومایسین 5/7 میلی گرم در لیتر منتقل شدند و در شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی در اتاق رشد قرار گرفتند. بعد از باززایی، استخراج dna ژنومی گیاه تراریخت انجام شده و با استفاده از تکنیک pcr حضور ژن اینترفرون گاما در گیاه تراریخت تایید گردید.